醫(yī)用鈦合金以其良好的生物相容性、高比強度和低彈性模量以及在生物環(huán)境下優(yōu)良的耐腐蝕性等優(yōu)點，在臨床上已成為廣泛的植入材料[1-3]，如骨科硬組織、口腔以及顱頜面骨等部位的重建與修復(fù)[4,5]。對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的鈦合金骨科植入物制造，傳統(tǒng)的減材制造技術(shù)，難以實現(xiàn)骨組織的結(jié)構(gòu)和生物力學的重現(xiàn)。隨著計算機輔助設(shè)計技術(shù)的日趨完善，3D打印技術(shù)與之結(jié)合，能夠針對人體骨組織不同缺損部位和形狀制造出具有復(fù)雜形狀和微孔特征的植入物，對骨科鈦基醫(yī)用金屬植入物而言，解決了“形”和“孔”的難題，從而實現(xiàn)植入物形狀和骨長入性能與宿主骨的適配，因此自3D打印鈦合金植入物上市以來，在骨科領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[6-8]。3D打印醫(yī)用鈦合金植入物多孔結(jié)構(gòu)可以促進骨組織的長入，不僅能夠加強植入物與骨組織的生物固定，還可能使應(yīng)力沿植入物向周圍骨傳遞[9-11]。Schmidt等[12]研究表明，在三維多孔結(jié)構(gòu)中的細胞，將會促進孔隙內(nèi)的組織分化，并指出三維多孔結(jié)構(gòu)更有利于干細胞向成骨細胞而非纖維細胞的分化，3D打印多孔鈦合金的表面形貌對成骨細胞的粘附、增殖以及骨膠原基質(zhì)的沉積具有積極的作用。由于以上優(yōu)勢，3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金植入物已經(jīng)在關(guān)節(jié)、骨盆腫瘤和脊柱疾病等治療上應(yīng)用，在臨床上已經(jīng)取得了顯著療效[13-16]。
3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金植入物除了良好的骨長入性能外，要保證其良好的臨床效果還依賴于其與組織器官的反應(yīng)處于可接受水平。特別是三維多孔結(jié)構(gòu)增大了植入物的比表面積，因多孔結(jié)構(gòu)造成暴露于體液介質(zhì)的表面積增大，三維貫通的孔隙結(jié)構(gòu)引起縫隙腐蝕概率更高，導(dǎo)致比傳統(tǒng)的實體鈦合金更易析出具有潛在毒性的Al/V等金屬離子。Jonitz等[17]通過體外靜態(tài)細胞試驗研究了3D打印多孔鈦合金的生物相容性，結(jié)果顯示在磨損過程中釋放出V離子，誘導(dǎo)活性自由基的釋放，從而對細胞的存活產(chǎn)生不利的影響。已有研究證實Al/V是對生物體有潛在毒副作用的元素，特別是V的生物毒性要超過Ni/Cr[18]，因此，減少或避免3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金植入物的金屬離子析出，是進一步提高3D打印鈦合金植入物安全有效性的有力措施。
KGulati等[19]利用陽極氧化技術(shù)在3D打印的鈦合金表面形成二氧化鈦，與傳統(tǒng)的鈦材料相比，用人成骨細胞檢測該3D打印鈦合金植入物的骨整合特性顯示成骨細胞的粘附力增強。因此，陽極氧化可以提高醫(yī)用鈦合金的生物相容性。已有的研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)的鈦合金經(jīng)過陽極氧化，能夠大大提高植入物的耐腐性，也在一定程度上能夠解決Al/V等金屬離子析出的問題[20,21]。雖然陽極氧化在傳統(tǒng)的鈦合金骨科植入物上廣泛應(yīng)用，但陽極氧化的3D打印多孔鈦合金骨科植入物研究與產(chǎn)品的臨床應(yīng)用報道并不多見。
因此研究陽極氧化的3D打印多孔醫(yī)用Ti-6Al-4V鈦合金的性能變化，尤其是離子析出特性，對于豐富3D打印醫(yī)用鈦合金基礎(chǔ)研究資料，以及開發(fā)相應(yīng)的植入器械具有重要指導(dǎo)意義。本文以電子束熔融技術(shù)打印的多孔Ti-6Al-4V鈦合金為例，采用著色陽極氧化工藝在3D打印多孔鈦合金表面制備氧化膜，研究了陽極氧化前后的3D打印多孔鈦合金顯微組織結(jié)構(gòu)和表面形貌變化，重點探討了陽極氧化表面處理前后在Hank′s模擬體液中的離子析出行為。
1、材料與方法
1.1多孔Ti-6Al-4V鈦合金著色陽極氧化
試驗采用電子束熔融設(shè)備（Arcam，Q10plus）打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金，成分符合GB/T13810-2017[22]規(guī)定，尺寸為φ10mm×10mm，通過Magics軟件對多孔鈦合金的表面積進行測算，表面積約為15cm2，多孔結(jié)構(gòu)的絲徑約為600μm，孔徑約為750μm，孔隙率約為65%。樣件經(jīng)過丙酮清洗、純化水超聲清洗、干燥后進行著色陽極氧化。著色陽極氧化在0.6mol/L硫酸溶液中進行，以樣件作為陽極，不銹鋼作為陰極，在電壓20V時，對樣件氧化5min后取出。將陽極氧化表面處理的樣件記為AIPS10/10型，作為試驗組，未做處理的記為IPS10/10型，作為對照組。
對樣件采用體積比為3∶7∶90的氫氟酸、硝酸和水的混合溶液進行腐蝕，并借助Axiovert200MAT/Zeiss光學顯微鏡進行顯微組織的觀察。采用JSM-IT300掃描電鏡觀察樣品表面形貌并進行能譜分析。
1.2金屬離子析出試驗
以Hank′s人工模擬體液作為浸提液，按照空白組（未加入鈦合金樣件）、對照組（加入3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金樣件IPS10/10）和試驗組（加入經(jīng)著色陽極氧化3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金樣件AIPS10/10）分類，將浸提液按照樣品表面積與浸提溶液體積1∶1的比例添加至離心管，密封放置在37℃的恒溫保溫箱（生產(chǎn)企業(yè)：上海一恒，型號：LRH-250），設(shè)定浸提時間為1d，1周，3周和5周。
每組樣品到達浸提時間后，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，Agilen，7800）測定Al離子、V離子和Ti離子的濃度。
2、結(jié)果
2.1多孔Ti-6Al-4V鈦合金著色陽極氧化
3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金陽極氧化前后的樣件如圖1所示，左側(cè)銀灰色柱狀多孔樣件為3D打印完成后的鈦合金樣件IPS10/10，在光學照片下可以看到多孔結(jié)構(gòu)；右側(cè)紫紅色柱狀樣件為經(jīng)過著色陽極氧化后的3D打印多孔鈦合金樣件AIPS10/10，可以看到氧化前后對產(chǎn)品的宏觀形貌沒有改變。
2.2顯微組織
圖2所示為3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金陽極氧化前后的金相組織照片。3D打印的多孔Ti-6Al4V合金的組織為α+β相，如圖2（a）和圖2（b）中所示，連續(xù)的晶界α相清晰可見，其間有片層狀的β相。經(jīng)過陽極氧化后，如圖2（c）和圖2（b）所示，多孔鈦合金顯微組織與氧化前基本一致，均為等軸晶的α+β相，晶粒較為粗大，相鄰α相片層組織之間存在尺寸很小的β相，存在部分等軸晶和連續(xù)的晶界α相。由此說明陽極氧化對3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金的顯微組織結(jié)構(gòu)沒有影響，雙相鈦合金的組織結(jié)構(gòu)沒有變化。Ti-6Al-4V是代表型的α+β兩相鈦合金，合金的微觀組織特征決定了合金的力學性能，3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金陽極氧化前后顯微組織一致，因此作為植入物的3D打印多孔合金的力學性能亦不會發(fā)生變化。
圖3（a）和圖3（b）所示為3D打印多孔Ti-6Al4V鈦合金陽極氧化前后的SEM照片，從圖中可以看出陽極氧化前后，多孔鈦合金絲徑形貌與尺寸未發(fā)生明顯變化，多孔結(jié)構(gòu)的絲徑和孔徑未受到影響。
3D打印多孔鈦合金表面熔融的鈦合金球形顆粒，經(jīng)過陽極氧化后仍然存在。表1為對應(yīng)的陽極氧化前后多孔鈦合金表面的元素含量。
2.3金屬離子析出
圖4和圖5為3D打印多孔鈦合金陽極氧化前后，在不同浸提時間時Al和V離子的析出濃度（Al：3.6μg/L，V：0.4μg/L）。對照組在第1天時Al離子析出濃度為12.9μg/L，隨著浸提時間的增加，Al離子持續(xù)析出，在第1周和第3周時，相對于第1天析出量明顯升高，浸提時間到第5周時，Al離子析出濃度達到54.6μg/L。在測試的浸提時間點，對照組中V離子的析出量均顯著高于試驗組。浸提3周時，對照組的V離子析出濃度達到最大值7.9μg/L，約為試驗組的10倍。整個測試周期內(nèi)，試驗組浸提液的V離子濃度最低為0.4μg/L，最大值為0.9μg/L，且在每個浸提測試點的測試值均小于對應(yīng)的空白組測試值。鈦合金陽極氧化在表面生成TiO2氧化膜，穩(wěn)定的TiO2中Ti離子的析出量極為稀少，因此在浸提測試中，試驗組和對照組中均未檢測到Ti離子析出。
3、討論
3.1組織結(jié)構(gòu)
通過對著色陽極氧化樣品的宏觀和顯微組織觀察，表明著色陽極氧化不會改變3D打印多孔鈦合金的結(jié)構(gòu)和顯微組織，從而保持其原有的力學性能。
與常規(guī)機加工鈦合金經(jīng)著色陽極氧化后的表現(xiàn)一致[23]，3D打印的多孔鈦合金陽極氧化后其表面元素種類未發(fā)生變化，為Ti、O、V、Al，未引入非基體元素，但氧元素含量明顯升高，高于氧化前的兩倍。這是因為3D打印的多孔Ti-6Al-4V鈦合金經(jīng)過陽極氧化后，表面形成一層更為致密、均勻、透明的氧化膜[24]，膜層主要成分為TiO2。
3.2金屬離子析出
3D打印多孔Ti-6Al-4V合金作為材質(zhì)的人工髖關(guān)節(jié)、人工膝關(guān)節(jié)和脊柱植入物等假體越來越多的應(yīng)用于臨床[13-16]，Al作為Ti-6Al-4V合金中α相穩(wěn)定元素，V作為β相的穩(wěn)定元素已成為保證植入力學性能中不可或缺的元素。但是Al和V具有潛在毒性，Al為非人體必需的微量元素，且Al與老年癡呆癥有密切關(guān)系，Al離子的析出可能引起神經(jīng)紊亂和貧血等不良癥狀，因此在生物醫(yī)學材料中應(yīng)避免該元素的存在。Hanawa等[25]研究了40余種金屬離子在纖維原細胞和成骨細胞中的毒性大小，發(fā)現(xiàn)V離子的毒性較大；V對生物體內(nèi)腎、肝、骨、脾等器官具有毒性作用。李雪峰等[26]研究了3D打印多孔Ti6Al-4V中Ti、Al、V在動物體內(nèi)的析出行為，檢測了實驗動物外周血、肝、腎及肌肉組織中的Ti、Al、V金屬離子濃度，結(jié)果顯示動物體內(nèi)Ti、Al、V的析出量無顯著差異，析出的金屬離子以Al為主，Ti和V析出量較少，均為微克級，遠低于犬骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)液中金屬離子濃度，證實了3D打印多孔Ti6Al-4V合金幾乎不會影響周邊細胞粘附及增殖，提示其具有良好的生物相容性。但是該研究同時說明在外周血中Al離子濃度隨著時間延長逐漸升高，Al離子的變化強烈提示了3D打印Ti-6Al-4V在選擇基材時應(yīng)對鋁離子加以關(guān)注，動物體內(nèi)Al離子的存在是否導(dǎo)致進一步的毒理病理變化，需要進一步分析。
本文擬通過對多孔Ti-6Al-4V合金進行陽極氧化處理的手段，進一步減少3D打印多孔鈦合金中的Al/V離子的析出，從而降低Al和V離子析出的潛在毒性風險。根據(jù)相關(guān)論著[26,27]研究表明常規(guī)機加工工藝的鈦合金表面形成的氧化膜利于細胞附著生長，同時保護基體避免腐蝕，本次試驗通過對3D打印多孔鈦合金進行陽極氧化處理，根據(jù)金屬離子析出實驗結(jié)果，陽極氧化后的多孔鈦合金樣品的浸提液中，Al離子和V離子濃度與未進行陽極氧化的樣品浸提液中離子濃度相比，有所降低，也證實陽極氧化能夠降低基體腐蝕。其中Al離子濃度在整個測試周期內(nèi)幾乎沒有明顯變化，Al離子的釋放濃度與空白組的測試值差異無統(tǒng)計學意義。陽極氧化的3D打印多孔鈦合金中的V離子在模擬體液中幾乎不析出。Ti離子在
整個浸提過程中均未檢測到。
因此對3D打印多孔鈦合金進行陽極氧化，是有效避免Al/V金屬離子析出，防止金屬離子析出導(dǎo)致毒理病理變化的可行方案，對目前3D打印多孔Ti6Al-4V合金植入器械的陽極氧化處理，是進一步提高植入假體安全性的有益途徑。
4、結(jié)論
（1）著色陽極氧化的3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金仍然為α+β雙相結(jié)構(gòu)，與氧化處理前的顯微組織特征一致，陽極氧化不影響3D打印多孔Ti6Al-4V的顯微組織結(jié)構(gòu)，因此不會對合金的力學性能造成影響。
（2）著色陽極氧化的3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金表面形貌未發(fā)生變化，也不會對多孔結(jié)構(gòu)的絲徑和孔徑造成影響。表面元素主要為Ti、O、Al和V，陽極氧化未引入非基體元素，由于表面形成TiO2膜，表面成分中O的含量增加。
（3）與陽極氧化前的3D打印多孔Ti-6Al-4V合金相比，著色陽極氧化多孔Ti-6Al-4V鈦合金在Hank's模擬人工體液中Al/V離子的析出量顯著降低，幾乎避免了金屬離子的析出。對3D打印多孔Ti-6Al-4V鈦合金進行陽極氧化處理是降低或避免Al/V離子析出的有效途徑，是進一步提高3D打印鈦合金骨科植入物安全性的可行措施。
5、致謝
感謝國家骨科與運動康復(fù)臨床醫(yī)學研究中心創(chuàng)新基金重點項目（23-NCRC-CXJJ-ZD1-1）提供的資金支持。
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